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相关的转化培养方法总汇

二、相关的转化培养方法总汇

方法一:

昆虫细胞转染:

1.Sf9细胞计数,取6孔板中的两孔,每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照),并以全培培养至少1小时,使细胞贴壁。

2.准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物:

a.溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。 b.转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium,混匀。 c.将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀,室温孵育20min。

3.重组质粒与转染剂混合液孵育的同时,以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。

4.取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中,轻轻混匀后,总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中,27℃继续培养5h。

5.移除质粒、转染剂混合物,加入2ml全培。27℃湿盒孵育,直到病变现象产生。

二、病毒贮液的制备:

1.病毒感染晚期(正常24-72h)可见细胞停止生长、黏附,呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清,500g离心5min,去除细胞和碎片。

2.上清即为P1病毒贮液,移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。

3.病毒贮液的扩增,按以下公式进行所需病毒P1贮液的量:

感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]

注:若不进行病毒空斑测定,P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。

4.扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下:

a.转染当天,取2×106个细胞/孔加入六孔板中,贴壁生长至少1h。

b.每孔加入适量的P1贮液,27℃湿盒孵育48h。

c.根均细胞病变情况(约48h后)收集各孔中的病毒上清液,500g离心5min取上清,即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。

d.制备了高效价的P2液后,按上述方法扩增P3贮液,用于高效表达。

方法二:

1、病毒扩增

大量培养Sf9细胞,待细胞长成单层处于对数生长期时用于病毒感染。具体操作包括:吸弃培养基,接种病毒,使病毒感染复数(MOI)小于1。室温吸附1h后除去病毒接种物,换以新鲜培养基,27℃培养48~72h,收集上清待用。

2、表达产物的检测

病毒定量感染和样品制备 接种2×106个处于对数生长期的Sf9细胞至25cm2细胞培养瓶中,使用高滴度病毒原液,病毒滴度(PFU/mL)至少为1×108有效病毒粒子/mL,且病毒感染复数(MOI)控制在5~10之间。病毒接种细胞吸附1h后,弃病毒液,换以新鲜的培养基27℃培养72h后,移弃培养基,预冷的PBS(pH7.4)缓冲液洗涤细胞数次。除尽残留液体,再加入500μL预冷的细胞裂解液(含有1×Protease inhibitor cocktail),用橡皮刮刮下细胞收集至eppendorf管内,置冰浴裂解45min,每50μL细胞裂解物分装至一个eppendorf管中,置于-20℃或者-80℃贮存备用或直接用于表达情况分析。

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